0.   引言

微生物诱导碳酸钙沉积（microbially induced carbonate precipitation, MICP）技术是一种新型加固土体的方法,该技术大都基于一种高产脲酶微生物,其利用自身新陈代谢活动产生脲酶,将尿素分解成${\text{NH}}_{\text{4}}^{+}$和${\text{CO}}_{\text{3}}^{\text{2}-}$,与周围环境中的Ca²⁺结合生成具有胶凝性且难溶的碳酸钙晶体,从而将砂颗粒胶结成具有一定强度的整体^[1-2]。由于MICP技术环境友好、资源丰富,目前被广泛应用于材料工程、岩土工程、环境工程等领域,如文物修复、土坡防护、地下金属稳定等^[3-6]。

尽管MICP技术在室内试验及现场试验中均取得了成功的应用,但在加固土体时仍面临一些挑战,产脲酶细菌的尺寸及好氧性会限制处理土体的类型和深度^[7]。实际上,脲酶不仅可由微生物分泌得到,还广泛分布于植物的种子中,包括一些品种的豆类和瓜类^[8]。植物源脲酶诱导碳酸钙沉积（enzyme induced carbonate precipitation, EICP）是MICP改良土体的一种替代方法,EICP技术相比MICP技术具有两个显著的优点：一是该技术直接利用小尺寸的游离脲酶诱导碳酸钙不易发生生物堵塞,且能够穿透更细颗粒的土体（如粉砂）；二是游离脲酶是可降解的,避免对环境造成长期影响^[9-11]。

近年来,Neupane等^[12]将尿素、氯化钙和脲酶的混合液注入到装有砂样的PVC圆筒中,获得具有一定硬度的样品,证实了酶促碳酸钙技术的有效性。Carmona等^[13]研究了固化时间、尿素、氯化钙和脲酶浓度对酶促碳酸钙沉淀过程的影响,并将该技术应用于砂土固化,发现能有效改善砂土的力学性能。实际应用中,脲酶成本制约着EICP技术的推广,商品化脲酶是以高纯度形式生产,用于医疗、食品等行业,因此价格高昂^[14]。为降低脲酶成本,许多学者利用实验室的基础设备提取植物脲酶,Nam等^[15]用磷酸缓冲液提取洋刀豆中的脲酶,并对比了脲酶粗提物与市售纯化脲酶沉积碳酸钙的能力,指出该植物脲酶粗提物具有替代纯化脲酶用于提高材料强度的潜力。Javadi等^[16]从西瓜籽中提取脲酶,并将其用于砂土EICP固化。

本文利用大豆提取脲酶,首先研究各因素对大豆脲酶活性的影响,然后进行EICP钙化试验,得到最优胶凝液浓度及不同条件下碳酸钙的沉淀产率情况,最后采用大豆脲酶和最优浓度胶凝液固化不同粒径的砂土,通过声时值、抗压强度及碳酸钙含量评价固化效果。

1.   材料及方法

1.1   大豆脲酶提取

试验用大豆为干燥的市售大豆,大豆脲酶提取方法如下：

（1）利用粉碎机将大豆粉碎,然后过100目的钢筛筛出豆粉,置于低温干燥的环境下备用。

（2）取一定质量豆粉置于烧杯中,然后按照豆粉质量与蒸馏水体积的比值为1∶10添加蒸馏水,得到的豆粉溶液通过磁力搅拌器充分搅拌30 min后,放置低温环境中静置 24 h。

（3）将豆粉溶液倒入离心瓶中,利用离心机以3000 r/min 离心15 min。

完成上述步骤后离心瓶中的上清液即为大豆脲酶粗提取液,最后将脲酶液置于低温条件下保存备用。按照该方法提取大豆脲酶液的成本约为1.0元/L。

1.2   脲酶活性测试

由于溶液电导率变化量与尿素水解量成正比,因此可通过测量溶液每分钟电导率变化值来间接衡量脲酶活性^[17]。本文将3 mL待测脲酶液与27 mL尿素溶液混合,并使用电导率仪监测 10 min内电导率变化情况,全过程温度维持不变,通过计算得到平均每分钟电导率变化值,然后根据 Whiffin^[17]提出的计算方法,1 mS/min 的电导率变化对应 11.11 mM urea hydrolysed/min 的尿素水解量,将平均每分钟电导率变化值换算成单位时间的尿素水解量,并乘以稀释倍数10,可得到脲酶提取液每分钟尿素水解量（$\text{mM urea hydrolysed}\cdot {\min }^{-1}$）,并用该值来表示脲酶活性,这与Neupane等^[12]采用的单位不一致,是因为其采用的商品化脲酶,呈粉末状固体,脲酶活性为2950 U/g（U为酶活力单位,1 U是指在25℃,最适条件下1 min内能分解的尿素量为1 μmol）。

1.3   EICP钙化试验

试验用胶凝液为等物质的量浓度的尿素和醋酸钙混合液。在试管中,将10 mL脲酶液与等体积胶凝液均匀混合,置于30℃的恒温箱中反应1 d后取出,通过酸洗法得到碳酸钙实际生成量,碳酸钙理论生成量可由C×V×M得到^[12],其中C（mol/L）为胶凝液的浓度,V（L）为胶凝液的体积,M（100.09 g/mol）为碳酸钙的摩尔质量,将碳酸钙实际生成量与理论生成量的比值记为碳酸钙产率。

1.4   砂土固化试验

本次采用3种不同粒径的砂土进行大豆脲酶固化试验,砂土颗粒粒径分别为<0.25 mm,0.25～0.5 mm,0.5～1 mm,各粒径砂土的颗粒级配曲线见图1,土粒相对密度、最大孔隙比及最小孔隙比见表1。

图  1  砂土颗粒级配曲线

Figure  1.  Grain-size distribution curve of sand

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表  1  砂土材料性质

Table  1.  Properties of sand materials

颗粒粒径/mm	土粒相对密度	最大孔隙比	最小孔隙比
<0.25	2.650	0.860	0.636
0.25~0.5	2.653	0.880	0.604
0.5~1	2.653	0.893	0.546

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试验采用内径为47 mm的PVC管,制备高度为10 cm的试样,各粒径试样设置3个平行样。试样制备过程如下：

（1）将3种粒径的砂土在105℃条件下烘干。

（2）利用带孔橡胶塞封堵PVC管底部并在管底铺两层纱布,取270 g左右砂土采用分层压实方法装入PVC管中,在砂土顶部铺两层纱布并塞上橡胶塞,制备后的试样相对密实度为0.60～0.64。

（3）从试样底部注入蒸馏水使试样饱和并排除多余气泡。

（4）利用蠕动泵以2 mL/min 的速率从试样底部灌注约为1.2倍孔隙体积的脲酶液,静置2 h,保证脲酶液充满砂颗粒间所有孔隙,控制相同速率灌注等体积胶凝液。每天按该步骤进行一次,固化时间为6 d。

1.5   超声波测试

利用声波检测仪验证试样固化效果。砂土固化完成后,先将PVC管两端的橡胶塞打开,连同PVC管的试样放置60℃烘箱中烘干48 h,由于球霰石是热力学上最不稳定的晶型,当温度超过60℃,球霰石可能会转化为文石^[18],此外温度过高容易导致含结晶水的物质晶格被破坏,因此,烘箱温度设置为60℃。然后将高度为10 cm的试样等分为3段,在各段中点处选择测点,依次记为A,B,C 3点,其距离试样底部分别为17,50及83 mm,超声波在各测点位置沿试样直径传播,以A,B,C 3处测点声时值差异验证试样纵向上胶结的均匀性。

1.6   无侧限抗压强度测试

对固化试样进行无侧限抗压强度测试,即在试样无侧向压力条件下,控制1 mm/min的加载速率,施加轴向压力至试样破坏,取最大轴向应力作为无侧限抗压强度。

1.7   碳酸钙含量测试

采用酸洗法得到碳酸钙生成量。将破坏后的试样浸泡于浓度为5 mol/L的稀盐酸中反应至无气泡产生,再用去离子水冲洗后,将砂土置于105℃烘箱中烘干至恒重,试样酸洗前后质量差为碳酸钙生成量。将碳酸钙生成量与原始砂土质量之比记为碳酸钙含量百分比。

2.   不同因素对脲酶活性影响

脲酶的化学本质是蛋白质^[19],其活性受温度及pH值的影响,因此,具体研究这两个因素对大豆脲酶活性的影响,得到大豆脲酶适宜的工作条件。

2.1   温度

为研究温度对大豆脲酶活性的影响,分别在15℃,25℃,35℃,45℃,55℃,65℃,75℃条件下,将3 mL脲酶液与27 mL 浓度为1.5 mol/L的尿素溶液混合,监测10 min内溶液电导率变化值,得到不同温度下大豆脲酶活性,结果见图2。

图  2  不同温度下脲酶活性

Figure  2.  Urease activity at different temperatures

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温度对脲酶活性的影响显著,在15℃～55℃范围内,脲酶活性随温度升高基本呈线性增大,15℃时,脲酶活性最低,每分钟尿素水解量为5.36 mmol/L,然而即使在低温情况下,大豆脲酶活性也比微生物脲酶活性高13倍左右^[17],表明提取的大豆脲酶活性较高。超过该温度范围后,脲酶活性的增长率先增大后减小,总体而言,脲酶能够耐受较高的温度而不发生失活。

2.2   pH值

为研究pH值对大豆脲酶活性的影响,配制浓度为1.5 mol/L的尿素溶液,将pH值分别调至6,7,8,9,10,取不同pH值的尿素溶液27 mL与 3 mL脲酶液混合,监测25℃条件下10 min内溶液电导率变化值,得到不同pH值下大豆脲酶活性,如图3所示。

图  3  不同pH值下脲酶活性

Figure  3.  Urease activity at different pH values

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pH值由6增大到10时,脲酶活性呈先增大后减小的趋势,pH值为8时,脲酶每分钟尿素水解量达最大,为7.55 mmol/L,因此,脲酶的最适pH值为8。pH值为6和10时,每分钟尿素水解量分别为7.32 mmol/L和7.17 mmol/L,与pH值为8条件下的脲酶活性相差不大,表明大豆脲酶对酸碱环境具有较强的耐受性。在EICP过程中,溶液pH值会随尿素水解而不断增加^[20],脲酶对酸碱的耐受性有利于其在实际工程中应用。

3.   EICP钙化试验

3.1   胶凝液浓度

为研究胶凝液浓度对碳酸钙生成量的影响,分别配制浓度为0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5 mol/L的胶凝液10 mL,向其中添加10 mL脲酶液,控制反应温度为30℃,测量1 d碳酸钙生成量并计算产率。

不同胶凝液下碳酸钙实际生成量与理论生成量对比图见图4。由图4可知,胶凝液浓度由0.25 mol/L增大到0.75 mol/L时,碳酸钙的实际生成量逐渐增多,产率逐渐增大,继续增大胶凝液浓度,碳酸钙产率降低,这是因为胶凝液浓度较低时,该脲酶浓度相对胶凝液过高,可能会抑制碳酸钙沉淀析出,因此,适当增大胶凝液浓度,碳酸钙产率会增大,但胶凝液浓度超过最适宜浓度时,脲酶的作用会受到限制,导致其催化水解尿素的能力降低,碳酸钙产率减小,此结论与Carmona等^[13]研究结果一致。考虑到胶凝液浓度为0.75 mol/L时,碳酸钙的产率最高可达84%,因此,将0.75 mol/L作为最优胶凝液浓度,后续砂土固化试验采用该浓度的胶凝液。

图  4  不同胶凝液下碳酸钙生成量

Figure  4.  Productions of calcium carbonate at different gel solution concentrations

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将0.75 mol/L胶凝液生成的沉淀烘干后进行XRD试验,图5为钙化产物的XRD图谱。根据图谱衍射峰确定大豆脲酶诱导沉淀的矿物成分为方解石。

图  5  沉淀产物的XRD图谱

Figure  5.  X-ray diffraction pattern of precipitate products

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3.2   pH值

为研究pH值对碳酸钙生成量的影响,配制浓度为0.5 mol/L的胶凝液,将pH值分别调至7,8,9,取不同pH值的胶凝液10 mL与10 mL脲酶液混合,控制反应温度为30℃,测量1 d碳酸钙生成量并计算产率。

不同pH值条件下碳酸钙产率见图6。pH值由7增大到9时,碳酸钙产率先增大后减小,pH值为8时,碳酸钙的产率最高可达82%,表明在该pH值条件下,溶液中钙离子及尿素的利用较充分,此结果与大豆脲酶最适pH值为8有一定关系。

图  6  不同pH值下碳酸钙产率

Figure  6.  Production rates of calcium carbonate at different pH values

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3.3   温度

为研究温度对碳酸钙生成量的影响,配制浓度为0.5 mol/L的胶凝液,将10 mL胶凝液与10 mL脲酶液混合,分别置于10℃,20℃,30℃,40℃条件下反应1 d,测量碳酸钙生成量并计算产率。

不同温度条件下碳酸钙产率见图7。由图可知,10℃,20℃,30℃,40℃条件下碳酸钙产率分别为54%,56%,58%,60%,表明随温度升高,碳酸钙产率逐渐增大,但增加的幅度较小,也即温度对碳酸钙生成量的影响不明显,这是因为脲酶活性较高,在不同温度下,脲酶的尿素分解量相差不大,此结论与Dilrukshi等^[21]的研究结果一致。

图  7  不同温度下碳酸钙产率

Figure  7.  Production rates of calcium carbonate at different temperatures

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3.4   反应时间

为研究反应时间对碳酸钙生成量的影响,配制浓度为0.5 mol/L的胶凝液,将10 mL胶凝液与10 mL脲酶液混合,控制反应温度为30℃,分别测量1 d,5 d,10 d碳酸钙生成量并计算产率。

不同反应时间条件下碳酸钙产率见图8。随反应时间增加,尿素不断被分解产生${\text{CO}}_{\text{3}}^{\text{2}-}$,与溶液中的Ca²⁺结合,生成更多的碳酸钙,因此,碳酸钙产率不断增大,碳酸钙10 d产率为96%,基本可将溶液中的尿素和钙离子全部利用,由此说明,大豆脲酶诱导碳酸钙沉积的可行性。

图  8  不同反应时间下碳酸钙产率

Figure  8.  Production rates of calcium carbonate at different reaction time

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4.   砂土固化试验

通过上述试验研究可知,大豆脲酶能够诱导碳酸钙晶体沉积,且在胶凝液浓度为0.75 mol/L时,碳酸钙产率最高。因此,采用循环灌注大豆脲酶提取液和0.75 mol/L胶凝液的方法,固化3种不同粒径的砂土。试样固化完成后,对其进行超声波测试、无侧限抗压强度测试及碳酸钙含量测试以评价固化情况。

4.1   声时值

超声波的传播速度会因介质的密实程度不同而改变,因此,将声时值作为评价固化试样密实性的一个指标,试样各位置的声时值差异表明其密实程度也即胶结程度不同,由此可验证胶结均匀性。试样固化后的声时值见图9。3种不同颗粒粒径砂土固化后的试样,A,B,C 3个测点的声时值均不相同,表明试样固化的均匀性较差,这是由于脲酶活性较高,在灌注胶凝液后,尿素立刻被分解产生${\text{CO}}_{\text{3}}^{\text{2}-}$,与溶液中的Ca²⁺结合生成碳酸钙晶体,对于较小粒径砂土（<0.25 mm）,碳酸钙晶体容易在灌注端沉积,导致A点声时值较小,而较大粒径砂土,由于砂土颗粒间孔隙较大,碳酸钙会被后续灌浆过程冲出,更多地沉积在出口端,因此,C点的声时值较小。相比颗粒粒径为<0.25 mm和0.5～1 mm的试样,粒径为0.25～0.5 mm试样的声时值整体较小,也即试样的密实性较好。

图  9  固化试样的声时值

Figure  9.  Values of sound time of solidified samples

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4.2   无侧限抗压强度

如图10所示,大豆脲酶诱导产生的碳酸钙晶体将砂土颗粒胶结成具有一定强度的砂柱。图11为试样固化后的抗压强度,由图可知,颗粒粒径对固化试样的抗压强度影响显著,颗粒粒径<0.25 mm时,试样的抗压强度最小为0.40 MPa,粒径为0.5～1 mm试样的抗压强度为0.62 MPa,粒径为0.25～0.5 mm试样的抗压强度最大可达1.21 MPa,通常材料越密实,其强度越高,该结果与声时值测试结果一致,由此说明植物脲酶的胶结效果与砂土颗粒间的孔隙尺寸有关。

图  10  固化完成的砂柱

Figure  10.  Solidified sand columns

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图  11  固化试样的抗压强度

Figure  11.  Compressive strengths of solidified samples

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4.3   碳酸钙含量

试样固化后的碳酸钙含量见图12。颗粒粒径为0.25～0.5 mm时,试样碳酸钙含量最高为9.74%,颗粒粒径为<0.25 mm和0.5～1 mm的试样碳酸钙含量分别为6.84%和6.97%,结合上述无侧限抗压强度测试结果,碳酸钙含量较高的试样其抗压强度也较大,这是因为碳酸钙晶体在砂土颗粒间起胶结和填充作用,对EICP技术改善土体力学性质有直接影响。

图  12  固化试样的碳酸钙含量

Figure  12.  Contents of calcium carbonate of solidified samples

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4.4   微观形貌

图13为EICP 处理后砂样的SEM图。由图13（a）可以看出砂颗粒表面及邻近砂颗粒之间均有碳酸钙晶体生成。随着EICP钙化反应的进行,生成的碳酸钙晶体不断堆叠尺寸变大,一部分碳酸钙晶体将砂颗粒与砂颗粒胶结起来,另一部分碳酸钙晶体填充砂颗粒间的孔隙,从而使得松散砂颗粒变成一个整体。但砂土颗粒间仍存在部分孔隙,表明生成的碳酸钙晶体不足以填充砂颗粒间所有孔隙。图13（b）为放大了10000倍的情况,发现采用大豆脲酶诱导的碳酸钙晶体形貌是大小不一的球形或球状聚集体。

图  13  固化试样的SEM图像

Figure  13.  SEM images of solidified sample

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5.   结论

本文从价格低廉、来源广泛的大豆中提取脲酶,在研究脲酶活性及钙化影响因素基础上,进行了大豆脲酶固化砂土试验。所得结论如下：

（1）直接提取大豆脲酶方法,操作简便,环保经济。提取的大豆脲酶活性较高,pH为6～10条件下,脲酶活性相差不大,相比其他情况pH为8时脲酶活性最高。15℃～75℃范围内,升高温度会增大脲酶活性。

（2）胶凝液浓度、pH值及反应时间对钙化的影响较大,胶凝液浓度较低（<0.75 mol/L）时,增大胶凝液浓度会提高碳酸钙产率,过高浓度的胶凝液会导致碳酸钙产率降低,胶凝液浓度一定时,pH值为8条件下最有利于碳酸钙晶体析出,且随着时间不断增加,钙化反应也在不断进行。10℃～40℃范围内,升高温度对钙化的影响不明显。

（3）通过EICP技术固化颗粒粒径为<0.25 mm、0.25～0.5 mm、0.5～1 mm的砂土,6 d时间松散砂土颗粒成功被胶结成具有一定强度的整体,但大豆脲酶的高活性导致碳酸钙晶体出现不均匀沉积,固化试样的均匀性较差,后续研究需对此进行改进。对于固化试样,砂土颗粒间孔隙尺寸大小直接影响大豆脲酶的胶结效果,碳酸钙晶体含量越多,获得的强度越大,颗粒粒径为0.25～0.5 mm的固化试样密实性最好,抗压强度最大为1.21 MPa。